基于对照制剂的牛黄清胃丸全处方鉴别研究等

牛黄清胃丸（Niuhuang Qingwei Pills，NQP）由人工牛黄、麦冬、栀子、黄芩、黄柏、枳实、大黄、薄荷、玄参、甘草、连翘、冰片、菊花、石膏、番泻叶、桔梗、牵牛子17味中药经粉碎、配研制成，具有清胃泻火、润燥通便的作用，用于心胃火盛、头晕目眩、口舌生疮、牙龈肿痛、乳蛾咽痛、便秘尿赤^[1-2]。现行标准收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第一册》，除性状外，仅收载了显微鉴别项，涉及大黄、黄芩、甘草、连翘、黄柏、栀子、菊花、薄荷、桔梗、枳实、玄参、麦冬、牵牛子13个药味。NQP处方药味众多，各药味的显微特征容易相互干扰，且辅料炼蜜颜色深，严重影响桔梗乳管、薄荷腺鳞等显微特征的辨识，对检验人员的技术和经验要求较高。处方中人工牛黄、番泻叶、石膏、冰片4个药味尚缺乏质量控制标准。随着中药质量控制水平的提高^[3-9]，大处方中成药的全处方（药味）鉴别成为中药标准研究和制定的必然目标。为全面控制NQP的质量，研究并新建了番泻叶、石膏的显微鉴别方法，提出了薄荷显微鉴别方法的改进方案，并新建了人工牛黄、大黄、冰片的薄层鉴别方法，实现了17个药味的全处方鉴别。

针对现有中成药质量标准“可判真伪，难辨优劣”的现状，创新性地将中药对照制剂引入中成药的质量评价。采用道地、优质、规范加工的原料药材（饮片）和辅料，严格按照制法和生产工艺规程，并遵循药品生产质量管理规范制备^[10]。中药对照制剂作为药品标准物质的新形式，具有化学信息丰富、价格低廉、稳定性好、具备指纹/特征图谱特性等优点，能够体现中成药的“配伍环境”和“化学轮    廓”^[11]，既为大处方中成药的显微鉴别提供了实物参照，又可用于半定量的薄层鉴别，为进一步建立药品等级标准提供客观依据。

KQ-300DA型数控超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；AE240、FX-200电子天平，Mettler公司；BX50-32H01生物显微镜，奥林巴斯公司；Linomat-5半自动点样台、REPORTSTAR薄层色谱摄像系统，Camag公司。

硅胶G薄层板购于Merck公司；水合氯醛、氨水、乙醇、醋酸乙酯、盐酸、乙醚、氢氧化钠、石油醚（60～90 ℃）、香草醛、硫酸、冰醋酸、正己烷、甲酸、甲酸乙酯、二氯甲烷（分析纯）、硅藻土购于北京市化学试剂公司；超纯水为RO-ZY-30型纯水机和Milli-Q纯水系统二次制备。

冰片对照品（批号110743-201706）、人工牛黄对照药材（批号121197-201204）、大黄对照药材（批号120902-201311）、菊花对照药材（批号121384- 201504）、麦冬对照药材（批号121013-201310）、薄荷对照药材（批号120916-201310）、栀子对照药材（批号120986-201610）、玄参对照药材（批号121008-201609）、番泻叶对照药材（批号120996-201205）、黄芩对照药材（批号120955- 201309）、甘草对照药材（批号120904-201620）、桔梗对照药材（批号121028-201612）、黄柏对照药材（批号121510-201606）、连翘对照药材（批号120908-201216）、牵牛子对照药材（批号121024-201606）、枳实对照药材（批号120936-201606）购自中国食品药品检定研究院。NQP对照制剂由中国食品药品检定研究院大生产规模（20倍处方量）研制，按该对照制剂的标定标准，鉴别、检查、含量测定、均匀性、稳定性等项目符合规定。石膏（批号20180103）购于北京华邈药业有限公司。炼蜜由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂提供。

18个厂家的48批NQP为2018年国家药品监督抽验样品，样品信息见表1（按国家药品抽验管理规定，厂家名称以代码表示）。

2.1   标准规定的显微鉴别

NQP对照制剂中13味药材的显微鉴别特征见图1。取本品，置显微镜下观察：草酸钙簇晶大，直径60～140 μm（大黄）；纤维淡黄色，梭形，壁厚，孔沟细（黄芩）；纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维（甘草）；内果皮纤维上下层纵横交错，纤维短梭形（连翘）；黄色纤维大多成束，周围细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维（黄柏）；种皮石细胞黄色或淡棕色，多破碎，完整者长多角形，长方形或形状不规则，壁厚，呈瘤状伸入胞腔，孔沟末端常膨大呈圆囊状，胞腔及孔沟含棕色物（栀子）；花粉粒类圆形，直径24～34 μm，外壁有刺，长3～5 μm，具3个萌发孔（菊花）；腺鳞头部8细胞扁球形，直径约至90 μm，柄单细胞（薄荷）；联结乳管直径14～25 μm，含淡黄色颗粒状物（桔梗）；草酸钙方晶成片存在于薄壁组织中（枳实）；石细胞黄棕色或无色，类长方形、类圆形或形状不规则，直径约至94 μm（玄参）；草酸钙针晶成束或散在，长24～50 μm，直径约3 μm（麦冬）；种皮栅状细胞淡棕色或棕色，长48～80 μm（牵牛子）。结果48批次样品均符合规定，合格率为100%，但部分样品的个别显微鉴别特征少见，推测因粉碎粒度过细、原料药材质量较差、投料量不足或混合不均匀等原因造成。在显微鉴别中引入采用优质原料足量投料的对照制剂，有助于快速辨识各药味的鉴别特征，为样品的检验提供有益参考。

2.2   新建番泻叶、石膏的显微鉴别方法

NQP中番泻叶、石膏2味原料，现行标准无质量控制项目。经实验研究，采用薄层色谱法鉴别番泻叶，特征成分在制剂中含量过低，斑点不明显。而石膏的理化鉴别（钙盐反应和硫酸盐反应）虽可行，但另一处方药味人工牛黄中含有无机盐^[12]，会造成假阳性干扰。采用显微方法鉴别番泻叶和石膏，特征明显，且制剂中其他药味无干扰。取本品，置显微镜下观察：草酸钙方晶密布纤维表面，非腺毛单细胞，长100～350 μm，直径12～25 μm，壁厚，有疣状突起（番泻叶）；不规则片状结晶无色，有平直纹理（石膏）。结果48批次样品均检出番泻叶和石膏，合格率为100%。NQP对照制剂中番泻叶、石膏的显微鉴别特征见图2。

2.3   改进薄荷显微鉴别方法

现行标准显微鉴别项下规定薄荷的鉴别特征为腺鳞，颜色极浅，在中成药尤其是大蜜丸中极难找到，如直接装片没有发现，常常需要对样品进行酸、碱浸泡，洗涤、离心、取沉淀装片观察，费时、费力，对检验人员的经验要求很高。经实验研究发现，薄荷的另一显微鉴别特征非腺毛在NQP中更为多见，且不受其他药味干扰。方中仅番泻叶和薄荷2味药材具非腺毛，形态差异明显（图2、3）。故将非腺毛补充入薄荷的显微鉴别项，和腺鳞以分号并列：“腺鳞头部8细胞扁球形，直径约至90 μm，柄单细胞；非腺毛1～8细胞，常弯曲，壁厚，微具疣状突起（薄荷）”，检出2个特征之一即可。结果48批次样品均检出薄荷非腺毛，NQP对照制剂中薄荷的显微鉴别特征见图3。

2.4   新建人工牛黄的薄层鉴别方法

现行标准对NQP君药人工牛黄缺少质量控制项目，采用薄层色谱法建立了鉴别方法。取本品5丸，加硅藻土15 g，研匀，加甲醇80 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水50 mL使溶解，用氨试液调pH值至9～10，用醋酸乙酯提取2次，每次50 mL，弃去醋酸乙酯液，水溶液用稀盐酸调节pH值至2～3，用乙醚提取3次，每次30 mL，合并乙醚液，用0.05%氢氧化钠50 mL提取，碱液再用乙醚洗涤3次，每次20 mL，弃去乙醚液，水溶液用稀盐酸调节pH值至2～3，用乙醚提取3次，每次30 mL，合并乙醚提取液，挥干。残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取人工牛黄对照药材20 mg，加乙醇10 mL，超声处理2 min，静置，取上清液作为对照药材溶液。取冰片对照品、大黄、菊花、麦冬、薄荷、栀子、玄参、番泻叶、黄芩、甘草、桔梗、黄柏、连翘、牵牛子、枳实对照药材、石膏、炼蜜，按NQP的处方和制法制得缺人工牛黄阴性样品，照供试品制备方法制得阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）实验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，人工牛黄对照药材溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯-甲醇-冰醋酸（6∶32∶1.5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点清晰，在紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光斑点。由图4可见，样品和NQP对照制剂斑点清晰、分离良好，阴性无干扰。48批次样品中，I厂家的1批样品未检出人工牛黄，合格率为98%。

2.5   新增冰片的薄层鉴别方法

现行标准对NQP中冰片缺少质量控制项目，采用薄层色谱法建立了鉴别方法。取本品5丸，加硅藻土15 g，研匀，加石油醚（60～90 ℃）50 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，滤渣备用，滤液作为供试品溶液。另取冰片对照品适量，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。取人工牛黄、大黄、菊花、麦冬、薄荷、栀子、玄参、番泻叶、黄芩、甘草、桔梗、黄柏、连翘、牵牛子、枳实对照药材、石膏、炼蜜，按NQP的处方和制法制得缺冰片阴性样品，照供试品制备方法制得阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）实验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，冰片对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-醋酸乙酯（8∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，105 ℃加热至斑点清晰，在紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，应显相同的黄绿色荧光斑点。由图5可见，样品和NQP对照制剂斑点清晰、分离良好，阴性无干扰。48批样品中，I厂家的1批样品未检出人工牛黄，合格率为98%。

2.6   新增大黄的薄层鉴别方法

冰片鉴别的药渣还可进一步用于NQP中臣药大黄的薄层鉴别，作为现行标准规定的大黄显微鉴别的有益补充。取“2.5”项下的滤渣，挥干溶剂，加二氯甲烷80 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加醋酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.1 g，加二氯甲烷20 mL，同法制成对照药材溶液。取冰片对照品、人工牛黄、菊花、麦冬、薄荷、栀子、玄参、番泻叶、黄芩、甘草、桔梗、黄柏、连翘、牵牛子、枳实对照药材、石膏、炼蜜，按NQP的处方和制法制得缺大黄阴性样品，照供试品制备方法制得阴性对照溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）实验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液、大黄对照药材溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同的黄色荧光斑点。由图6可见，样品和NQP对照制剂斑点清晰、分离良好，阴性无干扰。48批次样品均检出大黄，合格率为100%。

2.7   基于对照制剂的等级初评价

在建立全处方鉴别方法的基础上，将足量优质原料投料、规范生产的对照制剂引入具有半定量功能的薄层鉴别，可以根据样品和对照制剂色谱中，与对照品或者对照药材对应斑点大小的差异，对制剂进行等级初步评价。人工牛黄和大黄分别为NQP中的君药和臣药，冰片为贵细原料药材，利用本实验建立的3种薄层鉴别方法，随行对照制剂，对样品进行测定，可以为样品中3种原料的投料质量提供客观的评价依据。样品色谱中应检出的斑点按以下标准打分，0分：未检出相应斑点；1分：检出相应斑点，斑点明显小于对照制剂；2分：检出相应斑点，斑点大小与对照制剂基本相当；3分：检出相应斑点，斑点明显大于对照制剂。按3项薄层鉴别获得的总分对样品等级进行初评价，优等：≥6分，且无一项得1分及以下；合格：3～5分；不合格：任何一项得0分。按以上标准对18个厂家的48批样品进行等级初评价，结果显示I厂家的1批样品不合格，占2%；B厂家的2批、C厂家的3批、G厂家的1批、H厂家的3批、R厂家的1批，共计10批样品为优等，占21%；其余37批样品合格，占77%。

尝试以薄荷脑、薄荷对照药材；番泻叶苷A、番泻叶苷B、番泻叶对照药材为对照，研究薄荷、番泻叶的薄层鉴别方法，但因指标成分含量过低或阴性干扰等原因均未能成功。在此情况下，传统的显微技术反而能够在鉴别方面发挥很好的作用，与化学方法互为补充。将非腺毛与腺鳞以分号并列，作为薄荷的显微鉴别特征，大大降低了检验的难度。番泻叶的显微特征主要包括晶纤维、非腺毛和薄壁细胞中的草酸钙簇晶，前两者在NQP中更为多见，虽然番泻叶的晶纤维与方中黄柏的黄色晶纤维、甘草的晶鞘纤维各有不同，但为避免混淆，增加了非腺毛做为补充依据，要求同时检出晶纤维和非腺毛才可符合规定。

NQP是由17味原料药材制成的原粉制剂，处方药味众多，化学成分复杂，基质干扰严重。本实验总结了NQP现行标准规定的13味药材的显微鉴别特征，为相关检验工作提供了参考。进一步根据相应药味的质量特征，研究新建了番泻叶、石膏的显微鉴别项目和人工牛黄、大黄、冰片的薄层鉴别项目，并改进了薄荷的显微鉴别方法，填补了质量控制项目的缺失，为标准增修订提供了科学依据。

中药作为一类特殊的商品，也具有商品的一般特征，对中药商品的质量就有必然的要求。国家药品标准仅仅是中药需要满足的最低标准，可以依据其判断真伪，但往往难以衡量产品优劣^[11]。近两年来中药材等级评价标准研究开始得到重视^[13-14]，但对中成药的质量评价基本还停留在存在差异的阶段^[15-16]，尚未能提出质量等级评价的方法或标准。中成药一般为复方，处方药味在制剂过程中化学成分可能会相互影响而发生变化，这种变化是对照药材或对照提取物无法重现的。中药对照制剂按照和中成药品种相同的处方、制法研制，其色谱行为与实际样品更加一致，当其用于鉴别时，可有效弥补对照药材或对照提取物与药品斑点/色谱峰以及背景差异较大的问题，并为衡量样品中某味原料药材的投料的真伪、优劣、多少提供相对客观的依据。

本实验将中药对照制剂应用于所建立的全处方鉴别方法中，对NQP的等级进行了初评价，为中成药的等级标准研究做出了有益尝试，希望能对相关研究起到抛砖引玉的作用。后续还将建立多指标含量测定、指纹图谱和生物评价方法，并结合安全性指标，对NQP的等级标准进行更加深入的研究。

参考文献（略）

来   源：聂黎行，查祎凡，胡晓茹，张南平，戴   忠，于健东，马双成. 基于对照制剂的牛黄清胃丸全处方鉴别研究和等级初评价 [J]. 中草药, 2018, 49(22):5320-5327.

    “2018年中药质量与安全风险防控论坛暨中国中药协会中药质量与安全专委会年会”将于2019年1月5日-7日 在 广州 召开。下为本次大会官方微网站：

‍http://vurl.cn/qstcm2018‍‍‍

　　届时主管部门领导将到会讲解最新政策，权威专家阐述中药（含新型饮片）质量风险、等级评价等情况，本文作者也将莅临大会现场发表演讲。

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